紫外可見分光光度計(jì)測(cè)酶活性

酶在食品加工中的作用就像一把雙ren劍，我們要趨利避害。酶的積極作用我們要加強(qiáng)，在食品加工過程中添加酶制劑，使其作用充分發(fā)揮;消極作用我們要盡量避免，可以通過加熱等方法將酶滅活，消除其不利影響。

　　為了將酶更好地應(yīng)用于食品加工，研究酶的性質(zhì)是十分必要的。而紫外-可見分光光度法是研究酶性質(zhì)的重要方法之一。下面我們來(lái)介紹用-可見分光光度計(jì)測(cè)定酶活的具體方法。

　　紫外-可見分光光度法測(cè)定酶活性：

　　1. β半乳糖苷酶

　　一β一半乳糖苷酶，又稱乳糖酶（Lactase）。能水解乳糖來(lái)降低乳制品的乳糖含量，從而提高乳制品的可消化性，用于低乳糖牛奶和非結(jié)晶型濃縮牛奶的生產(chǎn)及奶酪風(fēng)味的改變，同時(shí)還可用于生產(chǎn)低聚半乳糖。

　　【酶活測(cè)定】以O(shè)NPG為底物測(cè)定β-半乳糖苷酶活力。

　　【酶活定義】以O(shè)NPG為底物，37℃保溫酶解，每分鐘釋放lμmol/L鄰硝基酚的酶量，定義為1個(gè)酶活力單位。

　　2. 超氧化物歧化酶

　　超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，簡(jiǎn)稱SOD）是一種十分重要的生物體防止氧化損傷的酶類，是生物體內(nèi)超氧陰離子清除劑，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。SOD廣泛存在于各類生物體內(nèi)，所有好氧微生物細(xì)胞中都含有SOD。自1969年Mccord等人發(fā)現(xiàn)了SOD生物活性后，醫(yī)學(xué)界對(duì)其醫(yī)療作用做了許多研究，證明它具有抗衰老、抗腫瘤、抗輻射、抗缺血、提高人體免疫力等作用，被專家稱為21世紀(jì)zui有前途的藥用酶。歐美國(guó)家已開始將其應(yīng)用于醫(yī)療、食品、保健、化妝品等領(lǐng)域。

　　【酶活測(cè)定】在25℃ 4.5ml 50mmol/L pH8.3的K2HPO4- KH2PO4緩沖液中加入待測(cè)SOD樣液，再加入10ul 50mmol/L的連苯三酚，迅速搖勻，倒人光徑lcm 的比色杯，在325nm波長(zhǎng)下每隔30s測(cè)一次A值。同時(shí)測(cè)定Sigma公司的SOD標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)所測(cè)樣品SOD活性進(jìn)行校正。

　　【酶活定義】在lml反應(yīng)液中，每分鐘抑制連苯三酚自氧化速率達(dá)50%時(shí)的酶量為一個(gè)酶活單位， 即325nm 0.035OD/min為一個(gè)酶活單位。

　　3. 多酚氧化酶

　　多酚氧化酶（PPO）是一類由核基因編碼在細(xì)胞質(zhì)中合成的含銅質(zhì)體的金屬酶，其作用機(jī)理在于銅的氧化-還原作用。大麥中的多酚物質(zhì)經(jīng)過PPO的催化氧化后，具有單寧性質(zhì)，易和蛋白質(zhì)起交聯(lián)作用而沉淀出來(lái)，進(jìn)而影響啤酒的色澤、泡沫、風(fēng)味和非生物穩(wěn)定性。大麥中部分PPO以“潛伏”狀態(tài)存在，在浸麥過程中，可通過去除一些酶抑制劑、蛋白酶作用或其他的一些方式使其活性在浸麥過程中提高。在大麥發(fā)芽過程中，PPO的活力較高，影響著麥芽的質(zhì)量。因此，在制麥過程中應(yīng)該降低PPO活性。

　　【酶活測(cè)定】0.1mL酶液與lmL 0.1 mol/L鄰苯二酚（用pH 8.4檸檬酸-磷酸緩沖液配制）80oC反應(yīng)3min，用2mL 20%TCA終止反應(yīng)，于波長(zhǎng)450nm處用分光光度計(jì)測(cè)定吸收值。

【酶活定義】上述條件下，將每分鐘OD值增加0.01定義為1個(gè)酶活力單位。

　　4.葡萄糖氧化酶

　　上世紀(jì)60年代以前，葡萄糖氧化酶主要用于蛋品加工業(yè)，除去葡萄糖，防止發(fā)生Maillard反應(yīng)，穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量，延長(zhǎng)保質(zhì)期。80年代末，又陸續(xù)開發(fā)了去除啤酒溶解氧和瓶頸氧改善風(fēng)味延長(zhǎng)保質(zhì)期、果汁果酒除氧護(hù)色穩(wěn)定質(zhì)量、面粉品質(zhì)改善、海產(chǎn)品和肉類保鮮、飼料添加去氧平衡畜禽胃腸代謝等用途，并建立了葡萄糖氧化酶專業(yè)生產(chǎn)車間。

　　【酶活測(cè)定】采用-聯(lián)（二）茴香胺分光光度法。在有氧存在條件下，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖脫氫產(chǎn)生H2O2，在過氧化物酶（POD）作用下，氧供體即鄰一聯(lián)（二）茴香胺（DH2）被氧化成棕色產(chǎn)物。于436nm處測(cè)量吸光率的變化，即可換算為葡萄糖氧化酶的活性。

　　【酶活定義】一個(gè)酶活性單位定義為在26℃下每分催化釋放一微克分子H2O2所需的酶量。

　　5. 果膠酶

　　果膠酶可以改善葡萄酒的色澤、增加酒香，并提高葡萄酒出汁率等，對(duì)提高紅葡萄酒的品質(zhì)有重要作用。

　　【酶活測(cè)定】向具塞試管中加入1.8mL 0.30% 聚半乳糖醛酸溶液（用0.05 mol/L Na2CO3/NaHCO3緩沖溶液配制，調(diào)節(jié)pH 10.0），于55℃水浴下保溫5 min，然后加入一定稀釋倍數(shù)的酶液0.2 mL反應(yīng)15 min，加入DNS試劑1.5 mL，混勻，在沸水中加熱10min，立即用自來(lái)水冷卻，再加入21.5 mL蒸餾水，混勻，于分光光度計(jì)上520 nm測(cè)定吸光度?？瞻子弥蠓惺Щ畹拿敢捍妗?/span>

　　【酶活定義】在上述試驗(yàn)條件下，以每分鐘分解底物產(chǎn)生1μmol半乳糖醛酸所需的酶量為1個(gè)酶活力單位。

　　6. 胰α-淀粉酶

　　【酶活測(cè)定】用移液管將0.5 mL酶溶液移入試管，并在水浴中調(diào)溫至25℃。加0.5 mL已同樣預(yù)熱到25℃的1%淀粉溶液。3 min后加1.0 mL DNS顯色劑。置試管于沸水中5 min，冷卻后用10 mL蒸餾水稀釋。用分光光度計(jì)于540 nm處以空白作對(duì)照測(cè)定吸光度。以0.5 mL磷酸鹽緩沖液代替酶液測(cè)定空白值。

　　7. 植酸酶

　　【酶活測(cè)定】 以植酸鈉為底物，采用釩鉬酸銨法測(cè)定植酸酶的酶活。吸取1 mmol/l的植酸鈉（酶作用底物，用0.25 mol/l、pH值5.50醋酸-醋酸鈉緩沖液配制）1.0 ml，37 oC預(yù)熱5 min后，準(zhǔn)確加入適當(dāng)稀釋的酶液0.5 ml（對(duì)照組先加反應(yīng)終止液），37 oC水浴反應(yīng)30min后，再加入4 ml反應(yīng)終止液（現(xiàn)用現(xiàn)配）冷卻至室溫，在415 nm處測(cè)定OD值，利用無(wú)機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出酶活。

　　【酶活定義】在37℃，每分鐘從1 mmol/l植酸鈉溶液中（用pH值5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液配制）釋放出1 nmol無(wú)機(jī)磷所需要的酶量為一個(gè)酶活單位。

8. 羧甲基纖維素酶

　　【酶活測(cè)定】在0.5mL適當(dāng)稀釋的酶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.625%的羧甲基纖維素鈉溶液，于50℃水浴中保溫30min，加2.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的NaOH溶液終止反應(yīng)，再加入2.5mLDNS試劑，于沸水浴中煮沸15min，冷卻，在550 nm波長(zhǎng)處比色，要求光密度讀數(shù)盡可能在標(biāo)準(zhǔn)曲線的0. 5 mg葡萄糖處。每次測(cè)定均設(shè)立空白對(duì)照，對(duì)照管先加入0.5mL酶液，然后加入2. 0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的NaOH溶液將酶滅活，再依次加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.625%的底物2. 0 mL，與待測(cè)管一起保溫，加入DNS，煮沸、冷卻、稀釋比色、與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照。

　　【酶活定義】在上述條件下，每30min產(chǎn)生0.5mg還原糖為1個(gè)Cx活力單位，即每1 h產(chǎn)生1.0mg還原糖為1個(gè)Cx活力單位。

　　9. 木聚糖酶

　　木聚糖酶能水解不可溶戊聚糖（阿拉伯木聚糖），使其成為水溶性的，水解率達(dá)65%。面粉中增加水溶性阿拉伯木聚糖，能提高面團(tuán)的持水性和機(jī)械強(qiáng)度，使面團(tuán)具有更好的持氣能力和操作耐力，進(jìn)而提高饅頭和面包的品質(zhì)。

　　【酶活測(cè)定】以木聚糖為底物，用DNS法測(cè)定還原糖的生成量。取稀釋酶液0.1ml，加1%木聚糖液0.9ml，置50℃水浴保溫30min后，加DNS 2ml于沸水浴中顯色3min，用自來(lái)水冷卻后，加蒸餾水定容25ml，測(cè)O.D值。

　　【酶活定義】每毫升酶液每分鐘水解木聚糖生成1μmol木糖所相當(dāng)?shù)拿噶俊?/span>

　　10. 蛋白酶

　　【測(cè)定原理】中性蛋白酶在一定的溫度和pH條件下，水解酪素底物產(chǎn)生含有酚基的氨基酸，在堿性條件下，將福林試劑還原，生成鉬藍(lán)與鎢藍(lán)，其顏色深淺與酚基氨基酸含量成正比。通過在660 nm測(cè)定其吸光度，可得到酶解產(chǎn)生的酚基氨基酸的量，計(jì)算出蛋白酶活力，以此代表蛋白酶的總酶活力。

　　【酶活測(cè)定】取3支試管（一支空白管，兩支樣品管），分別向3支試管中準(zhǔn)確加入稀釋好的待測(cè)酶液1.0 mL，將3支試管放入40℃水浴中預(yù)熱5 min，同時(shí)將測(cè)定底物（1%酪素）置同一溫度水浴中預(yù)熱5 min。分別向兩只樣品管中加入1%酪素溶液1.0 mL，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，反應(yīng)10 min取出。迅速準(zhǔn)確向兩只樣品管加入0.4 mol/L三乙酸2mL，于空白管中加入0.4 mol/L三乙酸2 mL和1.0 mL 1%酪素溶液，搖勻。3支試管中反應(yīng)液用濾紙過濾。另取3支試管，分別吸取上述相應(yīng)濾出液1.0 mL，0.4 mol/L碳酸鈉溶液5.0 mL和稀福林試劑1.0 mL，搖勻，置40℃水浴中放置20 min（顯色），取出，迅速冷卻置室溫。以空白管調(diào)儀器零點(diǎn)，在分光光度計(jì)波長(zhǎng)660 nm處分別測(cè)兩支樣品管吸光度，取平均值。通過查標(biāo)準(zhǔn)曲線求出生成酪氨酸的含量。

　　11. α-淀粉酶

　　α-淀粉酶是*個(gè)應(yīng)用于面包制作的微生物酶，它取代了麥芽是由于麥芽中的淀粉酶含量不穩(wěn)定而且含有蛋白水解酶。

　【酶活測(cè)定】在10 mL 試管中依次加入0. 5%可溶性淀粉溶液1 mL ， pH 4. 2的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液2. 5 mL， 40 ℃預(yù)熱10 min。然后加入多倍稀釋的0. 5 mL 酶液， 40 ℃保溫5 min后，加入0. 1 mol/L H2 SO4 1 mL 終止反應(yīng)。再取2 mL 反應(yīng)液與0. 5% KI - I2 溶液0. 5 mL顯色，測(cè)定OD620。與淀粉梯度標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照得反應(yīng)液淀粉濃度后，計(jì)算酶活力。

　　【酶活定義】在pH 4. 2、溫度40 ℃下， 5 min水解可溶性淀粉1 mg所需的酶量為一個(gè)酶活力單位 。

　　12. 脂肪酶

　　利用脂肪酶作用后釋放出的鏈較短的脂肪酸，增加和改進(jìn)食品的風(fēng)味和香味;利用脂肪酶催化的醇解和酯化反應(yīng)來(lái)生產(chǎn)各種香精酯，作調(diào)料劑;用有專一性的微生物脂肪酶提高食用油營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和增加食用油的花色品種，制備代可可酯等油脂;另外，脂肪酶還可以用于酒類的去濁除渣、改善面包質(zhì)量、改善蛋白的發(fā)泡等方面。

　　【酶活定義】在40℃、pH 7.5，以每分鐘從橄欖油中釋放lμmol脂肪酸的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

　　13. 漆酶

　　【酶活測(cè)定】3.0mL反應(yīng)液中含20 mmol/LABTS 0.7mL，酶液0.lmL和25 mmol/L琥珀酸緩沖液（pH4.5），在25℃下反應(yīng)2min后立即用冰浴終止反應(yīng)，測(cè)定436nm處吸光度的增量。

　　14. 木質(zhì)素過氧化物酶

　　【酶活測(cè)定】30℃條件下反應(yīng)體系中含酶液，濃度為0.2mol/L，且pH值為2.4的酒石酸緩沖液及濃度為0.008mol/L的黎蘆醇各lmL，加人濃度為0.016mol/L的H2O2 lmL 啟動(dòng)反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)zui初4min內(nèi)在310nm處的吸光度，以滅過酶活的酶液作對(duì)照。

　　15. 錳過氧化物酶

　　【酶活測(cè)定】室溫下反應(yīng)體系中含有50mmol/L pH4.5的乳酸鈉緩沖液3.4mL，1.6mmol/L的MnSO4溶液0.lrnL，酶液0.4rnL，加人1.6 mmol/L的H2O2 0.lmL啟動(dòng)反應(yīng)。測(cè)定反應(yīng)zui初4min內(nèi)在240nm處的吸光度。

　　【酶活定義】每分鐘使1μmol的Mn2+轉(zhuǎn)化成Mn3+所需要的酶量為一個(gè)酶活單位。